FC實驗步驟

一、細(xì)胞表面染色操作流程

1、細(xì)胞計數(shù)：將培養(yǎng)好的細(xì)胞收集于15mL離心管并計數(shù)；500g離心4min，去上清；

2、制備單細(xì)胞懸液：將收集的細(xì)胞用1mL 0.5%BSA/PBS溶液重懸，400g離心3min，去上清，重復(fù)2次；用0.5%BSA/PBS溶液重懸細(xì)胞至濃度1x106個細(xì)胞/mL，分配到96孔板中，每孔100μl細(xì)胞懸液；

3、(可選)阻斷Fc受體：室溫孵育10-20min；

4、一抗孵育：每孔加入稀釋后的一抗溶液100μl，2-8℃反應(yīng)30min；

5、洗滌：400g離心5min，去上清后加入200μl 0.5%BSA/PBS溶液重懸，離心去上清，重復(fù)兩遍；

6、二抗孵育：對于非熒光染料直標(biāo)抗體，加入100μl熒光二抗重懸，避光2-8℃反應(yīng)30min。對于直標(biāo)抗體直接跳到步驟8；

7、洗滌：400g離心5min，去上清后加入200μl 0.5%BSA/PBS溶液重懸，離心去上清，重復(fù)兩遍；

8、用200μl 0.5%BSA/PBS溶液重懸細(xì)胞，4℃保存，上機(jī)分析。

二、細(xì)胞胞內(nèi)染色操作流程

1、細(xì)胞計數(shù)：將培養(yǎng)好的細(xì)胞收集于15mL離心管并計數(shù)；500g離心4min，去上清；

2、制備單細(xì)胞懸液：將收集的細(xì)胞用1mL 0.5%BSA/PBS溶液重懸，400g離心3min，去上清，重復(fù)2次；用0.5%BSA/PBS溶液重懸細(xì)胞至濃度1x106個細(xì)胞/mL，分配到96孔板中，每孔100μl細(xì)胞懸液，400g離心5min去上清；

3、固定：每孔加入100μl細(xì)胞固定劑重懸細(xì)胞，2-8°孵育20min；

4、洗滌：400g離心5min，去上清后加入200μl 0.5%BSA/PBS溶液重懸，離心去上清，重復(fù)兩遍；

5、通透：每孔加入100μl細(xì)胞通透劑重懸細(xì)胞，室溫孵育20min；

6、洗滌：400g離心5min，去上清后加入200μl 0.5%BSA/PBS溶液重懸，離心去上清，重復(fù)兩遍；

7、(可選）阻斷Fc受體：10-20min；

8、一抗孵育：每孔加入稀釋后的一抗溶液100μl，2-8℃反應(yīng)30min；

9、洗滌：400g離心5min，去上清后加入200μl 0.5%BSA/PBS溶液重懸，離心去上清，重復(fù)兩遍；

10、二抗孵育：對于非熒光染料直標(biāo)抗體，加入100μl熒光二抗重懸，避光2-8℃反應(yīng)30min。對于直標(biāo)抗體直接跳到步驟11；

11、洗滌：400g離心5min，去上清后加入200μl 0.5%BSA/PBS溶液重懸，離心去上清，重復(fù)兩遍；

12、用200μl 0.5%BSA/PBS溶液重懸細(xì)胞，4℃保存，上機(jī)分析。